Практикум по Микробиологии (Лабораторные работы)
ПРАКТИКУМ ПО МИКРОБИОЛОГИИ
(с разделом Цитология)
Набора для проведения экспериментов по микробиологии.
Практикум по микробиологии 3
Общие указания к проведению лабораторных работ (Правила работы в лаборатории) 5 Л/р №1 Дезинфекция и стерилизация 7
Л/р №2 Исследование степени загрязненности воздуха помещений методом оседания Коха 10
Л/р №3 Выращивание на питательной среде микроорганизмов зубного налета 13
Л/р №4 Изучение морфологии бактерий, грибов, дрожжей 14
Л/р №5 Приготовление препаратов микроорганизмов и их окраска 19
Л/р №6 Строение плесневых грибов и дрожжей 26
Л/р №7 Микроорганизмы вред или польза 35
Л/р №8 Влияние факторов внешней среды на развитие микроорганизмов 36
Л/р №9 Изучение морфологии дрожжей 47
Л/р №10 Изучение культуральных свойств выросших в чашках колоний 50
Л/р №11 Выращивание микроорганизмов 53
Л/р №12 Выращивание своих собственных микроорганизмов 54
Л/р №13 Определение чувствительности микроорганизмов к антибиотикам 55
Раздел Цитологии. Л/р №14 Изучение плазмодесмы в клетках эндосперма хурьмы 56
Л/р №15 Молодые клетки зачатка листа 57
Л/р №16 Живые клетки чешуи лука 58
Л/р №17 Строение зрелого листа элодеи 59
Л/р №18 Биологические мембраны. Плазмолиз 60
Л/р №19 Строение лейкопластов 62
Л/р №20 Крахмальные зерна 63
Л/р №21 Методы обнаружения белков 64
Л/р №22 Методы обнаружения углеводов 66
Приготовление красителей 68
Список используемой литературы 72
Практикум по микробиологии
Разработан в соответствии с рабочей программой дисциплины «Биология и микробиология» для учеников школы и студентов, составленной на основе новых государственных стандартов. Он включает в себя лабораторные работы, которые охватывают основные разделы микробиологии.
Практикум составлен таким образом, чтобы закрепить теоретические знания по основным разделам курса, получить представление о строении живых организмов, показать их значение и развить у учащихся навыки практической работы. Поэтому перед каждой работой дается краткая теоретическая часть, необходимая для понимания эксперимента. Перед выполнением лабораторной работы учащиеся должны с ней ознакомиться.
При выполнении лабораторных работ студенты получают экспериментальные навыки, необходимые им для самостоятельной работы. Они осваивают методы биологического и микробиологического исследования, правила работы с биологическим материалом и культурами микроорганизмов.
Особое внимание уделено работе с микроскопом и правилам работы в лаборатории биологии и микробиологии. На первом занятии учащиеся должны ознакомиться с техникой безопасности, правилами работы в лаборатории и выполнять лабораторные работы в соответствии с этими правилами.
Результаты каждой лабораторной работы оформляются в виде отчета. Отчет выполняется рукописным методом в тетради или на отдельных листах с титульным листом на нечетной странице, у которого обратная сторона остается чистой. Далее следуют разделы в следующей последовательности: цель работы, задание, ход выполнения работы, таблицы, рисунки и общий вывод по результатам ее выполнения.
В основе лабораторных работ лежит Набор для проведения экспериментов по микробиологии.
ОБЩИЕ УКАЗАНИЯ К ПРОВЕДЕНИЮ
При выполнении лабораторных работ по биологии и микробиологии работают с различным биологическим материалом и культурами микроорганизмов. Изучают строение живых организмов и их основную структурную единицу – клетку. Клетки имеют небольшие размеры, поэтому невооруженным глазом их рассмотреть невозможно. Для их изучения готовят определенным образом препараты, которые рассматривают под микроскопом.
Микробиология изучает мельчайшие, невидимые невооруженным глазом существа – микробы. Они находятся повсюду: в почве, воздухе, воде, на сырье, различных материалах, оборудовании, продуктах питания и т. д. Одни из них безопасны для человека, другие могут вызывать различные заболевания.
Увидеть микроорганизмы, так же как и отдельные клетки, можно только под микроскопом, приготовив соответствующим образом препараты.
В лаборатории каждый работающий должен сидеть за отдельным столом.
В лаборатории должны быть созданы условия, обеспечивающие стерильность работы, при которых будет исключена возможность попадания как посторонних микроорганизмов извне, так и микроорганизмов из лаборатории в окружающую среду. Поэтому в микробиологической лаборатории необходимо строго соблюдать определенные правила работы и поведения, которые предотвращают возникновение заражения.
Правила работы в лаборатории
1. В помещение лаборатории нельзя входить без специальной одежды – халата.
2. Не разрешается выходить в халате за пределы лаборатории и надевать на халат верхнюю одежду.
3. В помещении лаборатории запрещается принимать пищу и хранить продукты питания.
4. Не выносить за пределы лаборатории какие бы то ни было посуду и материалы, которые используются для проведения лабораторных работ (пробирки, краски и т. д.).
5. Не класть на стол личные вещи (сумки, папки и др.), держать их на специально отведенных местах.
6. Если микроорганизмы попадают на оборудование или пол (разобьется пробирка или чашка Петри, на которой они росли), об этом надо сразу же сообщить преподавателю или лаборанту, а на данном месте провести обеззараживание, залив его дезинфицирующим раствором. После этого необходимо провести уборку.
7. Во время выполнения практических работ нельзя открывать форточки. Необходимо соблюдать тишину, избегать лишнего движения и хождения, открывания и закрывания дверей – всего того, что усиливает движение воздуха.
8. Перед началом работы дежурные проводят влажную уборку помещения, а столы протирают дезинфицирующим раствором.
9. Каждый учащийся перед началом работы должен проверить, все ли необходимое находится на его столе и исправен ли микроскоп.
10. Раздача необходимого для проведения лабораторной работы материала и посуды проводится лаборантом или дежурными.
11. На занятиях учащиеся должны иметь тетрадь и карандаши (простой и цветные – красный и синий). Рисунки при микроскопировании надо делать с препаратов, а не из книг или пособий.
12. По окончании работы все используемые инструменты обеззараживают. Бактериальные петли и иглы прокаливают над пламенем спиртовки, а пипетки и стекла помещают в дезинфицирующий раствор.
13. В конце занятий надо привести в порядок рабочий стол, протереть и убрать микроскоп, тщательно вымыть руки (при работе с заразным материалом их сначала дезинфицируют) и снять халат.
ЛАБОРАТОРНАЯ РАБОТА № 1
ДЕЗИНФЕКЦИЯ И СТЕРИЛИЗАЦИЯ
Ознакомиться с методами дезинфекции и стерилизации.
Материалы и оборудование: чашки Петри, пробирки, пипетки, парафильм или пищевая пленка, спиртовка
В естественных условиях микроорганизмы подвергаются воздействию разных по своей природе факторов внешней среды, которые могут либо стимулировать (стимулирующее действие), либо замедлять и прекращать их развитие, тормозя метаболические процессы (бактериостатическое действие), либо вызывать гибель микроорганизмов (бактерицидное действие).
В зависимости от своей природы все факторы делятся на физические, химические и биологические. Наиболее сильное воздействие на микроорганизмы оказывают следующие физические и химические факторы: температура, влажность, осмотическое давление, ультрафиолетовые лучи, ионизирующая радиация, ультразвук, различные химические вещества и рН среды. Многие из этих факторов используются для подавления жизнедеятельности микроорганизмов.
Дезинфекция широко применяется не только в лабораториях микробиологии, но и на различных пищевых предприятиях. В качестве дезинфицирующих веществ наибольшее практическое применение находят хлорная известь (0,5–5%-ные водные растворы), хлорамина (1–5%-ные водные растворы), йод (2%-ный раствор), фенол и его производные (1–5%-ные растворы), этиловый и изопропиловый спирт (70%-ные растворы).
Выбор дезинфицирующего вещества, его концентрация, продолжительность срока дезинфекции зависят от конкретных условий: от того, что именно подвергается дезинфекции, степени предполагаемого микробиального загрязнения, устойчивости обеззараживаемых микроорганизмов.
Стерилизация (обеспложивание) – это полное уничтожение всех микроорганизмов (вегетативных и споровых, патогенных и непатогенных) в обрабатываемом объекте. При проведении микробиологических исследований для получения правильных результатов необходимо обеспечить стерильность работы, т. е. не допустить попадания и развития посторонних микроорганизмов. Это достигается в результате проведения работ только при строго определенных условиях (определенных требованиях к помещению, оборудованию, посуде, питательным средам и т. д.).
Посуда, инструменты, питательные среды, используемые для работы в лаборатории микробиологии, должны быть стерильными, поэтому стерилизация является одной из важнейших операций в практике проведения микробиологических исследований.
Стерилизацию можно проводить различными способами: прокаливанием, паром под давлением, текучим паром, сухим жаром, кипячением, фильтрацией и др. Выбор способа стерилизации зависит от свойств стерилизуемого объекта, так как стерилизация не должна приводить к изменению его физического или химического состояния. Так, например, питательные среды никогда не будут стерилизовать сухим жаром, так как в их состав входит вода, которая при этом испарится.
Подготовить посуду к стерилизации.
Перед стерилизацией лабораторную посуду моют и сушат. Новую посуду вначале кипятят в воде, в которую добавляют соляную кислоту так, чтобы получился 1%-ный раствор, затем промывают холодной водой и, не вытирая, высушивают. Посуду, бывшую в употреблении, выдерживают в 20%-ном растворе серной кислоты в течение суток, затем моют в горячей воде, тщательно прополаскивают и высушивают.
Чашки Петри, пробирки и пипетки перед стерилизацией закрывают пленкой. Чашки Петри стерилизуют, завернув их в бумагу по 1–5 штук. В бумагу заворачивают и пипетки.
2. Приготовить к стерилизации 3–5 пробирок и 1–2 колбы. Для этого чистые пробирки и колбы закрывают пленкой.
3. Подготовить к стерилизации 3–5 пипеток.
В верхнюю часть каждой пипетки вставляют кусочек ваты, чтобы ее содержимое при работе не могло попасть в рот.
4. Подготовить к стерилизации вату и марлю.
Перед стерилизацией марлю нарезают кусочками, а вату сворачивают в виде шариков, после чего заворачивают их в плотную бумагу по 1–3 штуки так, чтобы она не разворачивалась. Удобно из бумаги сделать кулечки, положить туда вату или марлю и хорошо закрыть кулечки.
5. Провести стерилизацию посуды.
Подготовленную к стерилизации посуду и вату загружают в сушильный шкаф. Их кладут не слишком плотно, для того чтобы воздух мог хорошо циркулировать по всей камере и обеспечивался равномерный нагрев. После этого дверцу шкафа закрывают и включают нужную температуру.
6. Провести стерилизацию бактериальных петель.
Бактериальные петли стерилизуют в пламени спиртовки. Петли делают из нихромовой или платиновой проволоки, чтобы при прокаливании на них не появлялась окалина. Если петля сухая, то ее в вертикальном положении вносят в верхнюю, самую горячую часть пламени и прокаливают до красного каления сначала ее нижнюю, а затем верхнюю часть.
ЛАБОРАТОРНАЯ РАБОТА №2
Исследование степени загрязненности воздуха помещений методом оседания Коха
Воздух – это среда, содержащая огромное количество микроорганизмов, которые могут с воздухом переноситься на значительные расстояния. В воздухе микроорганизмы сохраняются лишь некоторое время, после чего гибнут из-за воздействия ряда факторов: солнечной радиации, перепада температуры, отсутствия необходимых питательных веществ. Наиболее устойчивые микроорганизмы могут долго сохраняться в воздухе. К такой постоянной микрофлоре воздуха относятся споры грибов и бактерий, сарцины и др.
В воздухе закрытых помещений могут содержаться загрязнения бактериальной и химической природы. Они являются следствием физиологических обменных процессов человека, бытовых действий (напр., приготовления пищи). В воздух помещений может поступать также комплекс продуктов деструкции полимерных отделочных материалов и т. д. Наконец, газовый состав воздух закрытых помещений определяется газовым составом приточного атмосферного воздуха и химическими веществами-загрязнителями, выделяемыми внутри помещений.
В воздухе закрытых помещений обнаруживаются микроорганизмы, постоянно обитающие в больших количествах на слизистых оболочках верхних дыхательных путей человека. Они выделяются в окружающую среду при чиханье, кашле, смехе и разговоре с мельчайшими частицами слюны и носоглоточной слизи.
Основная причина загрязнения воздуха помещений жилых и общественных зданий – накопление углекислого газа, аммиака, сероводорода, летучих жирных кислот и др. В воздухе закрытых помещений находится много бактерий, так как в большинстве таких помещений неизбежно массовое хождение, сопровождающееся поднятием в воздух пыли.
Исследование степени загрязнённости воздуха школьных помещений методом оседания Коха.
Материалы и оборудование: стерильные чашки Петри (5 шт.), алюминиевая фольга, стаканы с питательной средой, лупа, термостат. Стержень, основание штатива, марлевые повязки, перчатки, иглы, петли
Основной этап работы включает проведение опыта. Опыт проводится 2 раза: первый раз – в конце учебного дня, второй раз – через 2 в начале учебного дня. После проведения основной части каждого опыта (поверхностный посев), чашки Петри помещаются в термостат при t = +37°C на неделю, после чего регистрируются результаты исследования.
Заключительный этап работы включает подсчёт колоний микроорганизмов и количественный учёт микробов в 1 м 3 воздуха каждого исследуемого помещения, составление выводов по работе, обсуждение итогов исследования, подготовку фотоотчёта и презентации.
Культивирование (выращивание) микробов, в частности, бактерий проводится на питательных средах.
Методика проведения исследования
Метод заключается в том, что чашку Петри с МПА оставляют на некоторое время открытой (поверхностный посев), а затем закрывают крышкой и ставят в термостат при t = 37°C. О степени загрязнённости воздуха судят по количеству выросших колоний. Метод даёт приблизительные результаты количества микроорганизмов в единице объёма воздуха.
Чашки Петри с агаром ставим в разные помещения. Открываем на 5 минут, а затем закрываем. На крышке отмечаем место, где был проведён анализ. Чашки помещаем в термостат при + 37°С. (или в холодильник) Выдерживаем не более недели.
25 колоний – 78,5 см 2
Х колоний – 100 см 2
Х = 32 колонии
Вычисляем количество бактерий в 1м 3 воздуха (1000 л):
32 – 10 л
Х – 1000 л
Х = 3200 спор
Следовательно, в 1м 3 воздуха содержится 3200 спор клеток микроорганизмов.
Критерии для оценки загрязнённости помещений по числу микроорганизмов в 1 м 3 воздуха.
Результаты работы (как образец)
В ходе исследования для микробиологической оценки воздуха каждого помещения использовалось по 1 чашке Петри. На основании подсчёта колоний, выросших в чашках Петри, была проведена оценка содержания микроорганизмов в 1 м 3 воздуха помещения.
ЛАБОРАТОРНАЯ РАБОТА № 3
Выращивание на питательной среде микроорганизмов зубного налета
Вырастить и изучить микроорганизмы находящиеся в зубном налете.
Материалы и оборудование: чашка Петри, питательная среда Чапека, агар, шпатели, иглы, парафильм или пищевая пленка, зубочистки, марлевая повязка, перчатки.
Приготовить питательную среду и разлить ее по чашкам Петри, накрыть пленкой до опыта.
В чашке Петри на питательной среде оставить мазок с зубов
Наблюдать за ростом микроорганизмов
Охарактеризовать колонии микроорганизмов, использую теоретическую часть практикума.
ЛАБОРАТОРНАЯ РАБОТА №4
Изучение морфологии бактерий, грибов и дрожжей
Ознакомиться с морфологическим разнообразием бактерий и основными признаками, используемыми при их идентификации.
Материалы и оборудование: Микроскоп; пипетка; предметные стекла; спиртовка; иммерсионное масло; фильтровальная бумага; набор красок для окраски по Граму (фильтровальные бумажки с генцианвиолетом, растворы Люголя и фуксина рабочего) и окраски спор по Шефферу-Фултону (растворы бриллиантовой зелени и сафранина); 96 %-ный этиловый спирт; поднос для предметных стекол; промывалка; питательные среды с заранее выращенными бактериями и грибами; марлевая повязка, перчатки
Морфологические признаки бактерий
Бактерии объединяют обширную группу в основном одноклеточных микроорганизмов, разнообразную по форме, размерам и обмену веществ. Они являются прокариотными микроорганизмами.
При дифференциации бактерий путем микроскопии учитывают размеры и формы клеток, их взаимное расположение, химический состав и строение клеточных стенок, способность образовывать споры и капсулы, подвижность.
Основными формами бактерий, которые присутствуют в пищевом сырье, а также в продуктах растительного и животного происхождения, являются сферические бактерии (кокки) и палочковидные бактерии (палочки).
Палочковидные бактерии могут располагаться поодиночке, попарно ( диплобактерии ) и цепочками ( стрептобактерии ).
При идентификации палочек диагностическое значение имеют также расположение спор в клетках бацилл и клостридий, наличие и расположение жгутиков, способность образовывать капсулы.
Морфологические признаки грибов
Грибы относятся к царству Fungi (Mycetes, Mycota). Это многоклеточные или одноклеточные нефотосинтезирующие (бесхлорофилльные) эукариотические микроорганизмы с клеточной стенкой.
Грибы состоят из длинных тонких нитей (гиф), сплетающихся в грибницу, или мицелий. Гифы низших грибов — фикомицетов — не имеют перегородок. У высших грибов — эумицетов — гифы разделены перегородками; их мицелий многоклеточный.
Различают гифальные и дрожжевые формы грибов.
Гифы низших грибов не имеют перегородок. Они представлены многоядерными клетками и называются ценоцитными.
Взять чашки Петри с выращенными колониями грибов и бактерий, с помощью пипетки сделать микропрепараты бактерий и грибов.
Рассмотреть препараты под микроскопом.
Зарисовать увиденные клетки грибов и бактерий.
ЛАБОРАТОРНАЯ РАБОТА № 5
Приготовление препаратов микроорганизмов и их окраска
Научиться готовить препараты микроорганизмов и проводить их окраску.
1. Ознакомиться с приготовлением препаратов бактерий в «раздавленной» и «висячей» каплях.
2. Приготовить три препарата и окрасить их:
– первый – простым способом;
– второй – сложным способом (по Граму);
– третий – способом, при котором окрашиваются споры.
3. Промикроскопировать окрашенные препараты.
4. Оформить отчет, зарисовать увиденное под микроскопом в тетрадь и сделать выводы.
Материалы и оборудование: предметные стекла, иглы, петли, спиртовка, пинцет, генцианвиолет, йод, фильтровальная бумага, этиловый спирт, 96%р-р спирта, р-р Люголя, эфир, карболовый фуксин Циля, 0,5% р-р соляной кислоты, 5% р-р серной кислоты, метиленовая синь Лефлера, марлевые повязки, перчатки.
Микроскопирование микроорганизмов можно проводить на живых видах и в убитых культурах, в окрашенном и неокрашенном состоянии. Микроорганизмы содержат большое количество воды, и свет через них хорошо проходит, поэтому для того, чтобы увидеть их под микроскопом, необходимо правильно приготовить соответствующие препараты.
Препараты обычно готовят на предметном стекле. Помимо них, иногда используют и покровные стекла. Все стекла, используемые для приготовления препаратов, должны быть безупречно чистыми. Для этого их предварительно тщательно моют.
Для определения формы или выявления подвижности микроорганизмов их микроскопируют в живом состоянии. Для этого готовят препарат типа «раздавленная капля» или «висячая капля».
Раздавленная капля. Для приготовления этого препарата на середину предметного стекла наносят каплю воды или другой прозрачной жидкости и вносят в нее немного исследуемых микроорганизмов. Каплю осторожно накрывают («раздавливают») покровным стеклом. Для этого покровное стекло берут за грани, ставят на ребро у края капли и осторожно опускают, постепенно вытесняя воздух между покровным и предметным стеклом, чтобы не допустить образования в жидкости пузырьков воздуха.
Жидкость должна тончайшим слоем заполнить все пространство между стеклами, но не выступать за края покровного стекла. Излишек выступившей жидкости удаляют фильтровальной бумагой. Если жидкости недостаточно и между стеклами осталась воздушная полость, воду, наоборот, добавляют, подпуская ее стеклянной палочкой под покровное стекло, или заново переделывают препарат.
При исследовании бактерий и дрожжей, выращенных на плотной среде, берут небольшое их количество бактериологической иглой, предварительно прокаленной в пламени спиртовки и охлажденной. Затем вносят их в каплю воды, которую нанесли на предметное стекло, и тщательно перемешивают. При исследовании грибов берут небольшой комочек мицелия с помощью двух препаровальных игл (вставленных в пластмассовые или деревянные палочки). Мицелий помещают на предметное стекло в каплю смеси спирта и глицерина и осторожно расщепляют иглами, стараясь как можно лучше разъединить гифы.
Если исследуемые микроорганизмы (бактерии, дрожжи, споры грибов) находятся в жидкой среде, то на предметное стекло наносят каплю микробной суспензии (взвеси) без добавления воды или другой жидкости. Суспензию берут стеклянной палочкой или бактериологической петлей.
Микроорганизмы, находящиеся в препарате «раздавленная капля», можно изучать и в темном поле зрения. В этом случае толщина предметных стекол не должна превышать 1,2 мм, а покровных – 0,2 мм. Микроскопирование в темном поле проводят на обычном световом микроскопе, заменив в нем конденсор на темнопольный. В таком конденсоре центральная часть затемнена и свет проходит только через периферийную часть линзы. Он проходит его под углом, и поэтому в глаза исследователя прямые лучи света не попадают. Виден только свет, отраженный от микроорганизмов. Поэтому микроорганизмы видны на темном фоне как ярко освещенные частицы.
Для изучения подвижности микробов, процесса прорастания спор и т. д. готовят препарат типа «висячая капля». Для этого на середину необезжиренного покровного стекла наносят каплю жидкости с микроорганизмами. Края стекла смазывают вазелином, осторожно переворачивают и кладут на предметное стекло, которое посередине имеет углубление, так, чтобы капля находилась в углублении. Она должна свободно свисать, не касаясь краев или дна углубления.
В подавляющем большинстве под микроскопом рассматривают окрашенные препараты микроорганизмов. Окраска микроорганизмов зависит от физико-химических особенностей микробной клетки и взаимодействия ее структур и веществ с используемыми реактивами.
Способы окрашивания делятся на простые и сложные. При простых способах окраски используют один краситель, например фуксин. Такая окраска применяется для ознакомления с морфологией бактерий.
При сложных способах окраски применяют два или более красителя и используют различные обесцвечивающие вещества(чаще всего спирт). Такое окрашивание позволяет выявить детали строения микроорганизмов (споры, запасные питательные вещества и т. д.) и провести их дифференциацию (различить бактерии, сходные по внешнему виду, но принадлежащие к разным видам.) Окраска спор бактерий производится с применением притравы (кислот, щелочей) для разрыхления оболочки спор, что облегчает проникновение в них краски.
Независимо от того, каким способом будет вестись окраска микроорганизмов, предварительно надо приготовить, высушить и зафиксировать мазок. Фиксацию надо проводить для того, чтобы закрепить микроорганизмы на стекле. Только в этом случае микроорганизмы хорошо окрасятся, при окрашивании останутся на стекле и не будут смыты водой.
На середину чистого предметного стекла наносят каплю воды. В нее вводят немного бактерий, взятых с плотной питательной среды кончиком стерильной бактериологической иглы. Тщательно перемешивают петлей полученную суспензию (она должна быть слабомутной) и равномерно распределяют (размазывают) ее тонким слоем по поверхности предметного стекла на площади 2−3 см2.
Полученный мазок высушивают при комнатной температуре на воздухе или (для ускорения) в токе теплого воздуха пламенем спиртовки, не допуская перегрева стекла (стекло надо держать мазком вверх). После этого мазок фиксируют, для чего стекло с сухим мазком проводят 3−4 раза над пламенем спиртовки, прикасаясь к нему той стороной, где мазок отсутствует. Мазки бактерий можно фиксировать этиловым спиртом, смесью этилового спирта и эфира, а также другими веществами (фиксаторами).
2.1. Окраска простым способом.
На охлажденный фиксированный мазок наносят на 20–40 с 2–3 капли карболового фуксина Циля, после чего краску смывают водой из промывалки. Промывание заканчивают, когда вода станет бесцветной. Промытый препарат просушивают на воздухе. Для более быстрого высыхания нижнюю часть стекла и края, на которых нет препарата, можно промокнуть фильтровальной бумагой.
2.2. Окраска спор бактерий.
Для окраски спор готовят мазок бактерий так, как описано в п. 2.1, но не фиксируют его.
2.2.1. На сухой мазок наносят 1–2 капли 0,5%-ного раствора соляной кислоты и нагревают его в течение 1–2 мин над пламенем спиртовки (до выделения паров).
2.2.2. Остатки кислоты сливают, мазок промывают водой, высушивают на воздухе и фиксируют в пламени спиртовки (как указано в п. 4.1).
2.2.3. На охлажденный фиксированный мазок наносят 1–2 капли фуксина Циля и нагревают над пламенем спиртовки до появления пара. При этом необходимо следить, чтобы раствор краски не подсох.
2.2.4. Краситель смывают водой и погружают препарат в стаканчик с 5%-ным раствором серной кислоты на 20–40 с, после чего его сразу же промывают водой. При погружении в кислоту протоплазма клеток обесцвечивается, а споры остаются окрашенными.
2.2.5. На промытый препарат наносят на 3–5 мин метиленовую синь Лефлера (2–3 капли), после чего препарат тщательно промывают водой и высушивают.
При этом способе окраски споры окрашиваются в красный цвет, а клетки – в голубой.
3. Окрасить бактерии по методу Грама.
Сущность метода заключается в том, что бактерии последовательно окрашиваются красителем генцианвиолетом и йодом, а затем обрабатываются спиртом. При этом одни бактерии – грамположительные – остаются окрашенными, а другие – грамотрицательные – обесцвечиваются. Это связано с тем, что у грамположительных бактерий образовавшееся окрашенное соединение при обработке спиртом удерживается в протоплазме клетки, а у грамотрицательных оно вымывается из клетки.
Приготовить мазок так, как указано в п. 1.
3.1. На фиксированный мазок кладут полоску фильтровальной бумаги, наносят на нее в том месте, под которым находится мазок, 3–4 капли раствора генцианвиолета, и при помощи пинцета разглаживая бумагу, плотно прижимают к стеклу. Через 2 мин бумагу снимают, а излишки краски смывают водой.
3.2. На мазок наносят 3–4 капли раствора Люголя (раствор йода в йодистом калии) и по истечении 2 мин сливают его.
3.3. Препарат погружают в стаканчик с 96%-ным спиртом на 30–40 с и сразу же после этого промывают водой.
3.4. На препарат наносят на 2 мин разбавленный раствор фуксина. После этого промывают его водой и просушивают.
При данном способе окраски грамположительные бактерии будут фиолетовыми, а грамотрицательные – красными, так как после обесцвечивания спиртом они окрашиваются фуксином.
Внимание! При недостаточной обработке мазка спиртом все клетки сохраняют свою окраску, а при избыточной все обесцвечиваются.
Микроскопировать окрашенные препараты.
Все окрашенные препараты последовательно микроскопируют сначала с объективом 8х или 10х, а затем наносят на них каплю иммерсионного масла и микроскопируют с объективом 90х или 100х. Увиденное в микроскоп при большом увеличении (объектив 90х или 100х) зарисовывают в тетради. Делают выводы о наличии у разных микроорганизмов спор и об их отношении к окраске по Граму.